Amplification in vitro : PCR (Polymerase Chain Reaction) et séquençage

Thèmes abordés

biologie moléculaire, Amplification in vitro (PCR), gène, ADN, hybridation, amorces

Résumé du document

En diagnostic on utilise essentiellement la technique de PCR qui est une technique d'amplification du gène in vitro.
Le principe de la PCR, c'est donc une technique qui a été décrite en 1985 par Mr Mullis.
C'est un outil devenu indispensable en biologie moléculaire.
Prix nobel de chimie en 1993.
C'est une technique qui permet de disposer en quelques heures (2h) de plusieurs millions de copies d'une séquence donnée d'ADN.

Extraits

[...] On met dans le tube tout l'ADN génomique et on veut amplifier un exon de gène par exemple de 500pb. L'ADN matrice représentera à terme presque rien. Au bout de 25 cycles par exemple on obtient environ 33 millions de copies cibles. Elles représentent en gros la totalité de ce que l'on a dans le milieu réactionnel. Quand on fait une réaction PCR dans un tube essai, on ne voit rien. Pour voir quelque chose il faut faire une visualisation sur gel d'agarose. Le gel d'agarose est coloré au bromure d'éthydium. Il devient fluorescent sous UV. [...]

[...] Choix des amorces ou primers Ces amorces sont déterminées par logiciel. Les amorces doivent être rigoureusement spécifiques des 2 séquences qui encadrent la région que l'on veut amplifier. Leur spécificité est en premier lieu conditionné par leur taille. On considère qu'il faut au moins 18 pb (compris en 18 et 24pb) pour que la probabilité de retrouver une même séquence identique à un autre endroit du génome proche et générer une amplification parasite soit nulle. Les amorces ne doivent pas faire de boucle. [...]

[...] On observe des pics de couleur. La plupart des mutations sont des mutations hétérozygotes. Les superpositions de pics montrent une mutation. Applications Une des applications c'est le séquençage des produits de PCR. [...]

[...] Le nombre de cycles c'est la même chose, il y a un nombre de cycles minimum pour obtenir une amplification correcte. Si on dépasse 40 cycles on aura un risque d'amplification non spécifique. III Avantages et inconvénients Les avantages L'avantage c'est la rapidité, obtenir en 2 à 3h 2^30 copies d'un fragment d'ADN après 30 cycles, c'est magique. Surtout si on le compare au clonage qui est bien plus long. L'autre avantage c'est la sensibilité. On peut utiliser une très faible quantité de produit initial. [...]

[...] En général la température est fixée à une valeur en-dessous du Tm de telle sorte que ça puisse s'apparier correctement. Si on veut augmenter la spécificité de l'amorce on augmente la température. On se met dans des conditions dites stringentes La nature de la polymérase la Taq polymérase La polymérase a évolué au cours du temps. Lors de la mise au point de la technique de PCR on utilisait une polymérase ordinaire. Sauf qu'à chaque cycle quand on dénaturait l'ADN elle était thermo-sensible et donc elle était dégradée. [...]